Untersuchung zur Biosynthese aromatischer Sekundärmetabolite in Zellstrukturen von Sorbus aucuparia L. und Centaurium erythraea RAFN. (Tienda española)

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Benzoesäure und Benzoesäurederivate können in Pflanzen über vielfältige
Biosynthesewege gebildet werden. Es sind unterschiedlichste Mechanismen
für verschiedene Pflanzen beschrieben worden. Eine Aufklärung von
beteiligten Enzymen sowie die damit verbundene Darstellung der
Reaktionsabfolge der einzelnen Biosynthesewege ist bisher nur begrenzt
gelungen. Mit Zellkulturen von Centaurium erythraea steht ein interessantes
Modellsystem zur Untersuchung der Biosynthese von 3-Hydroxybenzoesäure
über Zwischenstufen des Shikimatweges zur Verfügung.
In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals in biochemischen Untersuchungen
die ATP-abhängige Biosynthese der 3-Hydroxybenzoesäure aus Shikimisäure
gezeigt werden. Das enzymatische Produkt wurde ausschließlich in Elicitorbehandelten
Zellkulturen von C. erythraea nachgewiesen, die neben dem
konstitutiv gebildeten 1-Hydroxy-3,5,6,7,8-pentamethoxyxanthon auch das
1-Hydroxy-3,5,6,7-tetramethoxyxanthon akkumulieren.
Untersuchungen zur Biosynthese der Benzoesäure wurden ebenfalls
durchgeführt, wobei p-Cumarat:CoA-Ligasen (4CL) in Zellkulturen von
Sorbus aucuparia bearbeitet wurden. Die 4CL wird in höheren Pflanzen von
Genfamilien kodiert. Eine Spezialisierung der einzelnen Isoformen liegt
aufgrund unterschiedlicher Substratspezifitäten, Expressionsmuster und
struktureller Organisation ihrer Gene nahe. 4CL-Isoformen lassen sich bei
einigen Pflanzen so der Lignin-Biosynthese oder anderen Phenylpropan-
Wegen zuordnen. Trotz unterschiedlicher Substratspezifitäten beschränkt sich
das Aktivitätsspektrum aller bekannten 4CLs auf Zimtsäurederivate.
Hier konnte mit Sa4CL2 die zweite p-Cumarat:CoA-Ligase aus S. aucuparia
identifiziert werden. Der ORF umfasst 1644 bp und kodiert für
547 Aminosäuren. Sa4CL2 hat eine Molekülmasse von ca. 62 kDa. Die
höchste katalytische Effizienz (Kcat/KM) zeigt sich gegenüber Ferulasäure und
Kaffeesäure, gefolgt von p-Cumarsäure und Zimtsäure. Sinapinsäure und
Benzoesäure werden nicht akzeptiert. Das pH-Optimum der Reaktion liegt bei
pH 7,5 und das Temperaturoptimum bei 35-40 °C. Die Reaktion ist abhängig
von divalenten Kationen, wobei mit Mangan und Magnesium die höchsten
Aktivitäten erzielt werden.
Für die drei bisher bekannten Sa4CL-Isoformen wurde hier eine differenzielle
Expression in unterschiedlichen Geweben nachgewiesen. Sa4CL2 und Sa4CL3
weisen daneben unterschiedliche Substratspezifitäten auf. Zusammen mit
signifikanten Unterschieden in der Primärstruktur der Proteine können
Sa4CL1 und Sa4CL2 der Klasse I der 4CLs (Lignin-Biosynthese) und Sa4CL3
der Klasse II (Flavonoid-Biosynthese) zugeordnet werden.
Eine massive Steigerung der 4CL-Expression in Elicitor-behandelten
Zellkulturen von S. aucuparia findet im Gegensatz zur starken Induktion der
Biphenyl-Synthase nicht statt. Sa4CLs scheinen folglich weder an der
Biosynthese noch der Aktivierung von Benzoesäure beteiligt zu sein. Eine
klassische Rekrutierung der 4CLs für die Lignin-Biosynthese und andere
Phenylpropan-Stoffwechselwege liegt nahe.
S. aucuparia bildet nach Pathogenbefall Phytoalexine vom Biphenyl-Typ. Das
mengenmäßig häufigste Biphenyl ist das Aucuparin. In dieser Arbeit wurde
ein Syntheseschema erarbeitet, das neben Aucuparin auch die isomeren
Dihydroxy-monomethoxybiphenyle und das isomere Monohydroxydimethoxybiphenyl
zugänglich macht. Ausgehend von einer Suzuki-Kupplung
sind so auch mögliche Zwischenprodukte der Aucuparin-Biosynthese leicht
darstellbar. Diese können als Substrate für die Untersuchung von O-Methyltransferase-Reaktionen wertvoll sein.