Apoptotische Prozesse in hippocampalen Primärkulturen (Tienda española)

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Die vorliegende Arbeit sollte dazu beitragen, die molekularen Grundlagen der Apoptose im Gehirn aufzuklären. Für diesen Zweck wurde ein Primärkultursystem aus dem Hippocampus neonataler Ratten etabliert, welches sich nach acht Tagen aus 30 % neuronalen und 70 % nicht-neuronalen Zellen zusammensetzte. Bei den nicht-neuronalen Zellen handelte es sich in erster Linie um Gliazellen. Der Proteinkinaseinhibitor Staurosporin wurde verwendet, um in den hippocampalen Primärkulturen eine Apoptose auszulösen. 300 nM Staurosporin führten zu Vitalitätsverlusten und zu einer Fragmentierung der Zellkerne, wobei von der Kernfragmentierung als erstes die Neurone betroffen waren. Desweiteren konnte eine deutliche Fragmentierung der DNA in oligonukleosomale Bruchstücke detektiert werden. Eine Aktivität der Caspase-3 wurde ebenfalls festgestellt. Sie war nach 5 stündiger Behandlung maximal ausgeprägt und betrug ca. das 10 fache des Kontrollwertes. Der Caspaseinhibitor ZVAD-fmk war in der Lage, den durch Staurosporin hervorgerufenen Vitalitätsverlust um rund 30 % zu vermindern. Eine Untersuchung der Zellkerne erbrachte jedoch keinen protektiven Effekt, vielmehr verursachte ZVAD-fmk einen Shift von fragmentierter zu kondensierter Kernmorphologie. Demnach ist eine Hemmung der Caspasen nicht hinreichend, um einen Zelltod in diesem Modell zu verhindern. Der Transkriptionsinhibitor Actinomycin D übte sowohl auf die Vitalität der hippocampalen Zellen als auch auf deren Kernmorphologie einen schädigenden Effekt aus. Folglich werden während der Apoptose in diesem Modell auf Ebene der mRNA nicht ausschließlich sogenannte “Killergene” aktiviert. Vielmehr ist denkbar, daß Staurosporin eine Erhöhung protektiver Gene induziert. Der zeitliche Expressionsverlauf verschiedener Gene, von denen man eine Beteiligung am apoptotischen Zellsterben annimmt, wurde nach Staurosporin-Behandlung mittels semiquanti­ta­tiver RT-PCR untersucht. Die Ergebnisse zeigten jedoch weder eine eindeutige Induktion noch eine Unterdrückung schädigender bzw. protektiver Gene. Die Erhöhung der Gen­expression für die SOD-2 und die HO-1 deutet auf eine Beteiligung von Sauerstoffradikalen bei der Staurosporin-induzierten Apoptose hin und kann als Schutzreaktion der Zellen interpretiert werden.