Biodiversity of marine-derived fungi and identification of their metabolites

Insgesamt wurden 31 Verbindungen aus Pilzen isoliert, die aus 12
verschiedenen marinen Organismen stammen, darunter Vertreter unterschiedlicher
Substanzklassen wie Alkaloide, Polyketide und Terpene. Eine Verbindung, ein
Pyranacetal, erwies sich dabei als neuer Naturstoff. Die Strukturen der Verbindungen
wurden durch massenspektrometrische Verfahren sowie ein- und zweidimensionale
NMR-Spektroskopie aufgeklärt.
1. Pilze aus der Klasse Eurotiomycetes
Sechs stickstoffhaltige Verbindungen wurden aus Penicillium polonicum, isoliert
aus dem marinen Schwamm Tethya sp., erhalten. Fünf davon, Cyclopenin,
Cyclopenol, Viridicatol, Viridicatin sowie 3-Methylviridicatin waren biogenetisch
verwandt.
Meleagrin, Roquefortin, Citrinin, Citrininhydrat und die Diastereomere
Quinolactacin A1 und A2 wurden aus Penicillium citrinum erhalten, welcher aus der
marinen Alge Sargassum sp. isoliert wurde. Meleagrin, Roquefortin und Citrininhydrat
zeigten eine beachtliche zytotoxische Wirkung gegen die murine Lymphomazelllinie
L5178Y, wohingegen Citrinin nicht aktiv war.
Das Anthrachinon Skyrin und die Preanthrachinone Atrovirin B1 und B2 wurden
aus einem Extrakt des aus dem Schwamm Aplysina aerophoba isolierten
Talaromyces wortmanii erhalten.
Zwei bekannte Verbindungen, Tenuazonsäure und Alternariol, wurden aus dem
Pilz Alternaria compacta erhalten, der aus dem marinen Schwamm Suberites
domuncula isoliert wurde.
2. Pilze aus der Klasse Sordariomycetes
Drei verwandte Alkaloide, Chaetomin, Cochliodinol und Semicochliodinol wurden
vom aus dem marinen Schwamm Tethya sp. isolierten Pilz Chaetomium sp. erhalten.
Alle zeigten starke zytotoxische Aktivität gegenüber L5178Y-Zellen und zeigten
inhibitorische Aktivität gegenüber Proteinkinasen.
Ein neues, mit der Familie der Cholesterolsynthesehemmstoffe Agistatine
verwandtes Pyranacetal wurde vom Pilz Xylaria sp. erhalten, der aus der marinen
Alge Padina australis isoliert wurde. Diese Verbindung wurde 3-Methylmethoxyagistatin
D genannt, basierend auf der Methylmethoxygruppe in Position C-3.
Daldinia escholzii aus der marinen Alge Halimeda berneoensis produzierte die
bekannte Verbindung 4,4’,5,5’-tetrahydroxy-1,1’-binaphthyl. Diese Verbindung zeigte
eine beträchtliche zytotoxische Aktivität gegenüber L5178Y-Zellen und erwies darüber
hinaus als Inhibitor von Proteinkinasen auf; beide Eigenschaften wurden bisher noch
nicht in der Literatur beschrieben.
Das Makrolid Zearalenon wurde von dem aus Sargassum sp. isolierten Pilz
Fusarium equiseti erhalten.
Indol-3-carbonsäure und das Diterpen Myrocin A wurden aus Arthrinium sp.
gewonnen, der aus Tethya sp. isoliert wurde. Myrocin A bewies zytotoxische Wirkung
und Aktivität als Inhibitor von Proteinkinasen. Die chemotaxonomische
Markersubstanz 5-Carboxymellein wurde aus dem Pilzstamm PV 1.1 erhalten.
Aufgrund dieser chemischen Befunde ist anzunehmen, dass dieser Pilz aus der
Familie der Xylariaceae stammt.
3. Pilze aus der Klasse Dothideomycetes
Die antimykotische Verbindung Griseofulvin wurde vom aus dem marinen
Schwamm Suberites domuncula isolierten Pilz Botryosphaeria stevensii erhalten;
damit erwies sich dieser Pilz als einer der wenigen bekannten Griseofulvin-
Produzenten außerhalb der Gattung Penicillium. Der aus dem marinen Schwamm
Petrosia ficiformis isolierte Pilz Paraphaeosphaera michotii produzierte die
Substanzen Cyclopenin, Cyclopenol, Viridicatol, Viridicatin und 3,4,8-Trihydroxy-1-
tetralon.
Die Bestimmung der Diversität der Pilze in marinen Organismen wurde mithilfe
der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern, die auf
konservierte, taxonomisch signifikante Gene gerichtet waren, durchgeführt, gefolgt
von denaturierender Gradientengelelektrophorese (DGGE). Das universelle
Pilzprimerpaar ITS1 und ITS4 erzeugte DNA-Amplifikate, die sich per DGGE trennen
ließen und eine Identifizierung der zugrunde liegenden Pilzstämme auf breiter Basis
erlaubten. Es konnte gezeigt werden, dass die DGGE unter Verwendung dieses
Primerpaares eine zuverlässige und aussagekräftige Methode zur Erfassung der
Diversität von Pilzen in komplexen biologischen Proben darstellt, insbesondere, was
Mangrovenpflanzen betrifft.
Pilz-Sequenzen konnten aus den DGGE-Experimenten mit Mangrovenpflanzen
erhalten werden, wobei zweifelsfrei nachgewiesen wurde, dass eine Bande jeweils auf
einen Pilzstamm zurückzuführen ist. Zwei Banden mit vergleichbarer Laufstrecke in
Proben der Rinde und Blätter von Avicennia marina wurden sequenziert und mittels
BLAST-Suche jeweils dem Pilz Alternaria sp. zugeordnet. Eine weitere, aus den
Blättern von Avicennia marina stammende Bande wurde nach Sequenzierung als
Fusarium sp. identifiziert.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig der erfolgreiche Nachweis von Pilz-
DNA im Gesamt-DNA-Extrakt von marinen Schwämmen auf der Basis von PCR und
DGGE geführt. Dabei zeigte sich, dass neben den Banden, welche Pilze
repräsentieren, auch solche auftraten, die auf DNA des Schwammes zurückgehen.
Allerdings ließen sich Banden von Schwamm-DNA von denen der Pilze durch ihre
unterschiedlichen Laufstrecken in den DGGE-Gelen sicher unterscheiden.
Anhand der Sequenzen aller im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Pilzstämme,
die auf Amplifikation mit dem Primerpaar ITS1 und ITS4 zurückgehen, wurde eine
phylogenetische Analyse durchgeführt. Der aus diesen Sequenzen konstruierte
phylogenetische Baum wurde mithilfe bioinformatischer Methoden validiert, und es
konnte gezeigt werden, dass er die Evolutionsgeschichte und Verwandtschaft
innerhalb des Reichs der Pilze bis herunter zur Gattungsebene wider gibt.