Vergleichende thermodynamische Analyse der Substratbindung an die rekombinante Oktopindehydrogenase aus der Pilgermuschel, Pecten maximus, und an die Laktatdehydrogenase aus dem Schweinemuskel.

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Opindehydrogenasen terminieren im Energiestoffwechsel verschiedener mariner Invertebraten die anaerobe Glykolyse, indem sie die reduktive Kondensation einer Aminosäure mit Pyruvat oder einer anderen -Ketosäure zu einem Opin und Wasser katalysieren, wobei NADH zu NAD+ reoxidiert wird. Bei Vertebraten sowie bei Crustaceen, Spinnen und Insekten übernimmt die Laktatdehydrogenase diese Aufgabe. Wie bei diesen Tieren die LDH, stellt bei vielen Mollusken die Oktopindehydrogenase einen adaptiven Mechanismus in Flucht- und Kampfreaktionen dar.
Zur Aufklärung der Struktur und des molekularen Reaktionsmechanismus der alternativen Pyruvatoxidoreduktasen erwies sich die Oktopindehydrogenase als besonders geeignet, da nach Aufklärung der Primärstruktur und heterologer Expression in E. coli das Enzym in ausreichender Menge und homogen zur Verfügung stand (Janßen, 2000). Obwohl biochemisch bereits gut charakterisiert, gibt es über den Reaktionsmechanismus der ODH jedoch widersprüchliche Informationen.
Durch einen Vergleich der thermodynamischen Parameter für die Substratbindung an ODH und LDH sollten einerseits der kinetische Mechanismus der ODH-Reaktion identifiziert und andererseits die Frage nach einem Selektionsvorteil durch den Besitz alternativer Pyruvatoxidoreduktasen für die verschiedenen marinen Invertebraten zumindest ansatzweise geklärt werden.
Die thermodynamische Analyse der Substratbindung an die rekombinante Oktopindehydrogenase hat gezeigt, dass diese nach einem geordnet-sequenziellen Mechanismus erfolgt. An das freie Enzym bindet zuerst die reduzierte Form des Coenzyms, NADH, wodurch eine Konformationsänderung hervorgerufen wird, welche die Bindung des ersten Substrats, L-Arginin, ermöglicht. Durch die Bindung des L-Arginins wird wiederum eine Konformationsänderung induziert, welche die Bindung des zweiten Substrats, Pyruvat, gestattet. Dadurch werden die Substrate in die räumliche Nähe des Nikotinamidrings gebracht. Erst dann ist der Hydridtransfer auf den Übergangszustand möglich, dem aus Pyruvat und L-Arginin gebildeten Imin. Sowohl die Substrate L-Arginin und Pyruvat als auch D-Oktopin können mit dem jeweils komplementären binären Komplex sogenannte ‚dead-end’-Komplexe bilden, die womöglich eine Rolle bei der Regulation der Enzymaktivität spielen.
Sowohl bei der LDH (Clark et al., 1989) als auch bei der ODH ist eine His-Asp-Arg-Triade an der Pyruvat-Bindung und an der Katalyse maßgeblich beteiligt (Janßen, 2000; Müller, persönliche Mitteilung). Trotzdem unterscheiden sich beide Dehydrogenasen in ihrer Affinität zum Substrat Pyruvat. Während Pyruvat mit einer hohen Affinität an einen binären LDH•NADH-Komplex bindet, war eine Bindung an einen ODH•NADH-Komplex nicht detektierbar. Es ist wahrscheinlich die L-Arginin-induzierte Konformationsänderung, welche die katalytische Triade in die für die Pyruvat-Bindung essentielle hydrophobe Umgebung bringt. Der kinetische Mechanismus der ODH-Reaktion ist also darauf ausgelegt, die Entstehung von L-Laktat in einem putativen ODH•NADH•Pyruvat-Komplex zu verhindern.
Neben der Regenerierung von Reduktionsäquivalenten wird durch die ODH-Reaktion auch die Konzentration freien L-Arginins verringert. In den Geweben mariner Lebewesen kommen freie Aminosäuren oft in hohen Konzentrationen vor, da sie diese für die Osmoregulation benötigen. Hohe Argininkonzentrationen haben sich dabei als ungünstig für den Organismus erwiesen. Aufgrund seiner positiven Nettoladung geht L-Arginin vielfach Wechselwirkungen mit den verschiedensten Metaboliten ein und hemmt Enzymaktivitäten. D-Oktopin hingegen zeigt diesen Effekt nicht (Bowlus und Somero, 1979). Durch die Bildung von D Oktopin könnten demnach, neben der Regenerierung von Reduktionsäquivalenten während starker Muskelaktivität, auch störende, hohe L-Argininkonzentrationen im Organismus vermieden werden. Offenbar scheint dieses für marine Invertebraten der einzige Vorteil der Oktopindehydrogenase gegenüber der Laktatdehydrogenase zu sein.