Development and Integration of Biocontrol Products in Branched Broomrape (Phelipanche ramosa) management in Tomato

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Summary

Parasitic weeds of the genera Striga, Orobanche, and Phelipanche pose a severe problem for agriculture because they are difficult to control and are highly destructive to several crops. The present work was carried out during the period October, 2009 to February, 2012 to evaluate the potential of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) to suppress P. ramosa on tomatoes and to investigate the effects of airdried powder and aqueous extracts from Euphorbia hirta on germination and haustorium initiation in Phelipanche ramosa. The work was divided into three parts: a survey of the indigenous mycorrhizal flora in Sudan, second, laboratory and greenhouse experiments (conducted in Germany and Sudan) to construct a base for the third part, which was a field trial in Sudan.

A survey was performed in 2009 in the White Nile state, Sudan to assess AMF spore densities and root colonization in nine fields planted with 13 different important agricultural crops. In addition, an attempt was made to study the relationship between soil physico-chemical properties and AMF spore density, colonization rate, species richness and other diversity indices. The mean percentage of AMF colonization was 34%, ranging from 19-50%. The spore densities (expressed as per 100 g dry soil) retrieved from the rhizosphere of different crops were relatively high, varying from 344 to 1222 with a mean of 798. There was no correlation between spore densities in soil and root colonization percentage. A total of 45 morphologically classifiable species representing ten genera of AMF were detected with no correlation between the number of species found in a soil sample and the spore density. The most abundant genus was Glomus (20 species). The AMF diversity expressed by the Shannon–Weaver index was highest in sorghum (H\= 2.27) and Jews mallow (H\= 2.13) and lowest in alfalfa (H\= 1.4). With respect to crop species, the genera Glomus and Entrophospora were encountered in almost all crops, except for Entrophospora in alfalfa. Kuklospora was found only in sugarcane and sorghum. The genus Ambispora was recovered only in mint and okra, while mint and onion were the only species on which no Acaulospora was found. The hierarchical cluster analysis based on the similarity among AMF communities with respect to crop species overall showed that species compositions were relatively similar with the highest dissimilarity of about 25% separating three of the mango samples and the four sorghum samples from all other samples.

Laboratory experiments studied the influence of root and stem exudates of three tomato varieties infected by three different Glomus species on germination of P. ramosa. Root exudates were collected 21or 42 days after transplanting (DAT) and stem exudates 42 DAT and tested for their effects on germination of P. ramosa seeds in vitro. The tomato varieties studied did not have an effect on either mycorrhizal colonization or Phelipanche germination. Germination in response to exudates from 42 day old mycorrhizal plants was significantly reduced in comparison to non-mycorrhizal controls. Germination of P. ramosa in response to root exudates from 21 day old plants was consistently higher than for 42 day-old plants (F=121.6; P<.0001). Stem diffusates from non-mycorrhizal plants invariably elicited higher germination than diffusates from the corresponding mycorrhizal ones and differences were mostly statistically significant.

A series of laboratory experiments was undertaken to investigate the effects of aqueous extracts from Euphorbia hirta on germination, radicle elongation, and haustorium initiation in P. ramosa. P. ramosa seeds conditioned in water and subsequently treated with diluted E. hirta extract (10-25% v/v) displayed considerable germination (47-62%). Increasing extract concentration to 50% or more reduced germination in response to the synthetic germination stimulants GR24 and Nijmegen-1 in a concentration dependent manner. P. ramosa germlings treated with diluted Euphorbia extract (10-75 % v/v) displayed haustorium initiation comparable to 2, 5-Dimethoxy-p-benzoquinon (DMBQ) at 20 μM. Euphorbia extract applied during conditioning reduced haustorium initiation in a concentration dependent manner. E. hirta extract or air-dried powder, applied to soil, induced considerable P. ramosa germination.

Pot experiments were undertaken in a glasshouse at the University of Kassel, Germany, to investigate the effects of P. ramosa seed bank on tomato growth parameters. Different Phelipanche seed banks were established by mixing the parasite seeds (0 – 32 mg) with the potting medium in each pot. P. ramosa reduced all tomato growth parameters measured and the reduction progressively increased with seed bank. Root and total dry matter accumulation per tomato plant were most affected. P. ramosa emergence, number of tubercles, and tubercle dry weight increased with the seed bank and were, invariably, maximal with the highest seed bank. Another objective was to determine if different AM fungi differ in their effects on the colonization of tomatoes with P. ramosa and the performance of P. ramosa after colonization. Three AMF species viz. GIomus intraradices, Glomus mosseae and Glomus Sprint® were used in this study. For the infection, P. ramosa seeds (8 mg) were mixed with the top 5 cm soil in each pot. No mycorrhizal colonization was detected in un-inoculated control plants. P. ramosa infested, mycorrhiza inoculated tomato plants had significantly lower AMF colonization compared to plants not infested with P. ramosa. Inoculation with G. intraradices, G. mosseae and Glomus Sprint® reduced the number of emerged P. ramosa plants by 29.3, 45.3 and 62.7% and the number of tubercles by 22.2, 42 and 56.8%, respectively. Mycorrhizal root colonization was positively correlated with number of branches and total dry matter of tomatoes.

Field experiments on tomato undertaken in 2010/12 were only partially successful because of insect infestations which resulted in the complete destruction of the second run of the experiment. The effects of the inoculation with AMF, the addition of 10 t ha-1 filter mud (FM), an organic residues from sugar processing and 36 or 72 kg N ha-1 on the infestation of tomatoes with P. ramosa were assessed. In un-inoculated control plants, AMF colonization ranged between 13.4 to 22.1% with no significant differences among FM and N treatments. Adding AMF or FM resulted in a significant increase of branching in the tomato plants with no additive effects. Dry weights were slightly increased through FM application when no N was applied and significantly at 36 kg N ha-1. There was no effect of FM on the time until the first Phelipanche emerged while AMF and N application interacted. Especially AMF inoculation resulted in a tendency to delayed P. ramosa emergence. The marketable yield was extremely low due to the strong fruit infestation with insects mainly whitefly Bemisia tabaci and tomato leaf miner (Tuta absoluta). Tomatoes inoculated with varied mycorrhiza species displayed different response to the insect infestation, as G. intraradices significantly reduced the infestation, while G. mosseae elicited higher insect infestation.

The results of the present thesis indicate that there may be a potential of developing management strategies for P. ramosa targeting the pre-attachment stage namely germination and haustorial initiation using plant extracts. However, ways of practical use need to be developed. If such treatments can be combined with AMF inoculation also needs to be investigated. Overall, it will require a systematic approach to develop management tools that are easily applicable and affordable to Sudanese farmers. It is well-known that proper agronomical practices such as the design of an optimum crop rotation in cropping systems, reduced tillage, promotion of cover crops, the introduction of multi-microbial inoculants, and maintenance of proper phosphorus levels are advantageous if the mycorrhiza protection method is exploited against Phelipanche ramosa infestation. Without the knowledge about the biology of the parasitic weeds by the farmers and basic preventive measures such as hygiene and seed quality control no control strategy will be successful, however.

Zusammenfasung

Parasitäre Wildkräuter der Gattungen Striga, Orobanche und Phelipanche stellen ein akutes Problem für die Landwirtschaft dar, weil sie schwer zu kontrollieren sind und destruktiv auf eine Reihe von Kulturpfanzen wirken. Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 2009 bis Februar 2012 durchgeführt, um das inhibierende Potenzial von Mykorrhizapilzen (Englisch: arbuscular mycorrhizal fungi (AMF)) auf P. ramosa bei Tomaten zu bewerten. Dabei wurden die Auswirkungen von lufttrockenem Pulver und wässrigem Extrakt aus Euphorbia hirta auf die Keimung und Haustoriuminitierung in P. ramosa untersucht. Die vorliegende Doktorarbeit ist in drei Teile geliedert: a) Recherche zur einheimischen Mykorrhizaflora Sudans, b) Labor- und Gewächshausexperimente (in Deutschland und Sudan), um die Grundlage für c) einen weiteren Feldversuch im Sudan zu konstruieren.

Im Jahr 2009 wurde eine Untersuchung im White Nile state, Sudan, durchgeführt, um die AMF-Sporendichte und -Wurzelbesiedlung in neun Feldern mit 13 verschiedenen und wichtigen Kulturpflanzenarten zu beurteilen. Darüber hinaus wurde der Versuch unternommen, die Beziehung zwischen physikalischchemischen Bodeneigenschaften und AMF-Sporendichte, -Kolonisationsrate, – Artenreichtum und weitere Diversitätsindizes zu erkunden. Der durchschnittliche Anteil der AMF-Kolonisierung betrug 34% und varierte zwischen 19 und 50%. Die Sporendichten (ausgedrückt als 100 g pro Boden (trocken)) verschiedener Pflanzenrhizosphären war relativ hoch und variierte von 344 bis 1222 mit einem Mittelwert von 798. Eine Korrelation zwischen Sporendichte im Boden und der Wurzelbesiedlung wurde nicht gefunden. Insgesamt konnten 45 Arten aus zehn Gattungen morphologisch klassifiziert werden. Eine Korrelation zwischen der AMFArtenzahl und der Sporendichte in den Bodenproben konnte nicht festgestellt werden. Die am häufigsten vorkommende Gattung war Glomus (20 Arten). Die AMF-Diversität, verdeutlicht durch den Shannon-Weaver-Index, war am höchsten bei Sorghum (H/=2,27) und Corchorus olitorius (Jews mallow) (H/=2,13) und am niedrigsten bei Luzerne (H\=1,4). Die Gattungen Glomus und Entrophospora wurden in fast allen Kulturen angetroffen, mit Ausnahme von Entrophospora in Luzerne. Kuklospora wurde nur bei Zuckerrohr und Hirse gefunden. Die Gattung Ambispora wurde nur in Minze und Okra entdeckt, während Minze und Zwiebeln die einzigen Arten waren auf denen keine Acaulospora gefunden wurde. Hierarchische Cluster-Analysen basierend auf der Ähnlichkeit zwischen den AMF-Gemeinschaften je Kultur zeigten, dass Artenzusammensetzungen relativ ähnlich waren, wobei die größten Ungleichheiten von etwa 25% zwischen drei der Mango-Proben und vier der Sorghum-Proben und dem Rest auftraten.

In den Laborexperimenten wurde der Einfluss von Wurzel- und Stammexsudaten infizierter Tomaten mit drei Glomus-Arten auf die Keimung von P. ramosa untersucht. Wurzelexsudate von drei Tomaten sorten wurden 21 oder 42 Tage nach den Topfen (DAT) und Stammexsudate 42 DAT gesammelt und deren Wirkungen auf die Keimung von P. ramosa Samen in vitro getetstet. Die Keimung als Reaktion auf Exsudate aus 42 Tage alten mykorrhizierten Pflanzen im Vergleich zu Nicht- mykorrhizierten Kontrollen war signifikant reduziert. Die Keimung von P. ramosa als Reaktion auf Wurzelexsudate von 21 Tage alten Pflanzen war durchweg höher als für 42 Tage alte Pflanzen (F = 121,6, P <.0001). Stammexsudate aus nicht- mykorrhizierten Pflanzen provozierten durchweg höhere Keimungensraten als Exsudate aus den entsprechenden mykorrhizierten Pflanzen, wobei Unterschiede meist statistisch signifikant waren.

Weiterhin wurde eine Serie von Laborexperimenten durchgefuehrt, um die Auswirkungen wässriger Extrakte von E. hirta auf die Keimung, Wurzelverlängerung und Haustoriuminitiation von P. ramosa zu untersuchen. P. ramosa Samen, die zuerst Wasser Konditioniert wurden und anschließend mit verdünntem E. hirta-Extrakt (10-25% v/v) behandelt, keimten zwischen 47 und 62%. Steigende Extraktkonzentration von 50% und mehr reduzierte die Keimung im Vergleich zu synthetischen Stimulanzien wie GR24 und Nijmegen-1 in einer konzentrationsabhängigen Weise. P. ramosa-Keimlinge, die verdünnten Euphorbia-Extrakten (10-75% v/v) ausgestst wurden, wiesen Haustoriuminitiationen auf, die vergleichbar zu den von ausgetsben DMBQ bei 20 μM waren. Euphorbia-Extraktanwendungen während der Konditionierung reduzierte die Haustoriuminitiation in einer konzentrationsabhängigen Weise. Sowohl in Boden eingebrachte E. hirta-Extrakte als auch lufttrockenes Pulver, induzierten die Keimung von P. ramosa erheblich.

Topfexperimente unter Gewächshausbedingungen wurden an der Universität Kassel, Deutschland, durchgeführt, um die Auswirkungen von P. ramosa Samenbank auf Tomatenwachstumsparameter zu untersuchen. Dazu wurden verschiedene P. ramosa Samenbanken durch Mischen der Parasitensamen (0-32 mg) mit Blumenerde erzeugt. P. ramosa verminderte alle gemessenen Wachstumsparameter, wobei die Verminderung mit jeder Stufe zunahm. Die Wurzel- und Gesamttrockensubstanzakkumulation pro Tomatenpflanze war der am stärksten betroffene Parameter. P. ramosa Aufkommen, Zahl der Tuberkel und das Tuberkeltrockengewicht stieg mit der Samenbank und erreichte, ausnahmslos, Maximalwerte bei höchstem Samenbankniveau.

Ein weiteres Ziel war es festzustellen, ob verschiedene AM Pilze sich in ihrer Wirkung auf die Besiedelung von Tomaten mit P. ramosa und deren Leistung von P. ramosa nach der Kolonisierung unterscheiden. GIomus intraradices, Glomus mosseae und Glomus Sprint (eine kommerzielle Mischen) wurden dazu verwendet. Für die Infektion wurden P. ramosa Samen (8 mg) mit den oberen 5 cm Boden je Topf vermischt. Es wurde keine Mykorrhizierung in den uninokulierten Kontrollpflanzen festgestellt. Die mit P. ramosa befallenen, mykorrhizainokulierten Tomatenpflanzen zeigten eine signifikant niedrigere AMF Kolonisation im Vergleich zu nicht befallenen Pflanzen. Inokulation mit G. intraradices, G. mosseae und Glomus Sprint® reduzierte die Zahl der aufkommenden P. ramosa Pflanzen um 29,3, 45,3 und 62,7% und die Zahl der Tuberkel um 22,2, 42,0 und 56,8% betragen. Die Mykorrhizawurzelbesiedlung war positiv mit der Zahl der Äste und der Gesamttrockensubstanz der Tomaten korreliert.

Feldversuche mit Tomaten im Winter 2010/11 und 2011/12 waren nur teilweise erfolgreich, weil starker Insektenbefall zur vollständigen Zerstörung des zweiten Durchlaufs führte. Während dieses Experiments wurde die Auswirkung der Beimpfung mit AMF, die Zugabe von 10 t ha-1-Filter Schlamm (Englisch: filter mud (FM)), ein organischer Rest aus der Zuckerherstellung und 36 bzw. 72 kg N ha-1 auf den P. ramosa Befall von Tomaten bewertet. In nicht mit AMF inokulierten Kontrollpflanzenvariante die AMF Kolonisation variierte zwischen 13,4 bis 22,1% ohne signifikante Unterschiede zwischen FM- und N-Behandlungen. Das Hinzufügen von AMF oder FM führte zu einer signifikanten Zunahme der Verzweigung der Tomatenpflanzen ohne additive Effekte. Die Trockengewichte wurden durch die FM-Anwendung und ohne N leicht und signifikant mit 36 kg N ha-
1 erhöht. Es konnte keine Wirkung von FM bis zum ersten P. ramosa Aufkommen festgestellt werden, wohingegen AMF- und N-Anwendung interagierten. Besonders die AMF Beimpfung führte tendenziell zu verzögertem P. ramosa Aufkommen.

Der marktfähige Ertrag war aufgrund des starken Fruchtbefalls mit Insekten, v. a. durch die Weiße Fliege Bemisia tabaci und die Tomaten-Miniermotte Tuta absoluta äußerst gering. Tomaten, die mit unterschiedlichen Mykorrhizaarten beimpft wurden zeigten unterschiedliche Reaktion auf den Insektenbefall. So verringerte G. intraradices den Befall deutlich während G. mosseae einen verstärkten Insektenbefall hervorrief.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen Perspektiven zur Entwicklung von Management Strategien auf Basis von Pflanzenextrakten für P. ramosa auf, die die Frühphase der Keimung und Haustoriumsinitiierung zum Ziel haben. Diese müsen allerdings für die Praxis entwickelt werden. Ebenfalls muss die Kombinierbarkeit mit AMF Inokulation überprüft und optimiert werden. Insgeamt bedarf es eines Systemansatzes, um im Sudan anwendbare Methoden zu entwickeln. Diese müssen für die Landwirte leicht einsetzbar und nicht zu teuer sein.

Es ist allgemein bekannt, dass angemessene agronomischen Praktiken, wie z. B. die Gestaltung einer optimalen Fruchtfolge in Anbausystemen, reduzierte Bodenbearbeitung, Förderung von Gründüngung, die Einführung von multimikrobiellen Impfstoffen und die Einhaltung eines adequaten Phosphatspiegels von Vorteil sind, wenn die Mykorrhiza-Schutzverfahren gegen den Phelipanche ramosa Befall ausgeschöpft sind. Ohne Wissen um die Biologie des Parasiten und die Anwendung der notwendigen grundlegenden präventiven Methoden wie Hygienemaßnahmen und Saatgutkontrolle, kann jedoch keine Kontrollstrategie zum Erfolg führen.