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Skalenübergreifende Produktion und Sekretion rekombinanter Proteine mit Stämmen der Gattung Bacillus

Printausgabe
EUR 37,00

E-Book
EUR 25,90

Skalenübergreifende Produktion und Sekretion rekombinanter Proteine mit Stämmen der Gattung Bacillus (Band 80)

Antonia Lakowitz (Autor)

Vorschau

Inhaltsverzeichnis, PDF (49 KB)
Leseprobe, PDF (110 KB)

ISBN-13 (Printausgabe) 9783736995765
ISBN-13 (E-Book) 9783736985766
Sprache Deutsch
Seitenanzahl 138
Umschlagkaschierung matt
Auflage 1.
Buchreihe Schriftenreihe des Institutes für Bioverfahrenstechnik der Technischen Universität Braunschweig
Band 80
Erscheinungsort Göttingen
Promotionsort Braunschweig
Erscheinungsdatum 04.07.2017
Allgemeine Einordnung Dissertation
Fachbereiche Biologie
Maschinenbau und Verfahrenstechnik
Schlagwörter Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Antikörperfragment, Penicillin-G-Acylase, rekombinant, Sekretion, Protease
URL zu externer Homepage https://www.xing.com/profile/Antonia_Lakowitz
Beschreibung

Biopharmazeutika wie Antikörper und Hormone repräsentieren etwa ein Fünftel der kommerziellen Pharmazeutika. Für die rekombinante Produktion dieser Proteine sind diverse Stämme der Gattung Bacillus vielversprechende alternative Kandidaten. Sie sind einfach zu kultivieren, apathogen und sekretieren korrekt gefaltete Proteine mit hoher Effizienz. Einige der anspruchsvollsten heterologen Proteine sind Antikörper und ihre Fragmente sowie große multimere Enzyme wie die Penicillin-G-Acylase (Pac). Antikörperfragmente werden aufgrund ihrer hoch-spezifischen Antigen-Bindung vielfach therapeutisch, diagnostisch und analytisch eingesetzt, wobei single-chain fragment variable (scFv) das kleinste herkömmliche Format darstellt. Pac wird für die Herstellung semisynthetischer β-Lactam-Antibiotika benötigt. Gegenstand dieser Arbeit ist die skalenübergreifende rekombinante Produktion und Sekretion des Antikörperfragments D1.3 scFv und der Pac mit B. megaterium, B. licheniformis sowie mit B. subtilis-Stämmen unterschiedlicher Protease-Aktivität.
Die Produktion, Sekretion und Reinigung des D1.3 scFv wurde durch ein Plasmid ermöglicht, das einen Xylose-induzierbaren, für B. megaterium optimierten, Promotor und Sequenzen für das Signalpeptid SPlipA und einen fusionierten His6-Tag aufweist. Die Sekretion von funktionalem D1.3 scFv wurde für B. megaterium MS941, B. licheniformis MW3 sowie B. subtilis 168, DB431 und WB800N in einem angepassten Minimalmedium gezeigt. Skalenübergreifend erfolgte die Produktion in Mikrotiterplatten (1,25 mL), Schüttelkolben (150 mL) und Rührkesselreaktoren (2.000 mL). Es wurden extrazelluläre Konzentrationen von 15 130 mg L 1 erzielt. Für B. subtilis stiegen Menge und Stabilität des D1.3 scFv, je geringer die Protease-Aktivität des Stammes war.
Für die rekombinante Produktion der Pac wurden ebenfalls Xylose-induzierbare Plasmide konstruiert. Die Sekretion konnte für B. megaterium MS941 und ATCC14945 sowie für B. subtilis 168 und WB800N im Schüttelkolben (150 mL) gezeigt werden. Die maximalen extrazellulären Aktivitäten betrugen 0,3 0,65 U mL 1, wobei die Protease-Defizienz in MS941 bzw. WB800N auch hier eine Aktivitätszunahme bewirkte. Ein fusionierter C terminaler His6-Tag wirkte sich negativ auf die Pac-Aktivität aus.
Das hohe Potenzial von Stämmen der Gattung Bacillus für die rekombinante Produktion von pharmazeutisch relevanten anspruchsvollen Proteinen wie Antikörperfragmenten und großen multimeren Enzymen konnte skalenübergreifend von 1,25 bis 2.000 mL Kulturvolumen demonstriert werden. Mit 130 mg L 1 wurden die bisher höchsten extrazellulären Konzentrationen eines Antikörperfragments für ein Gram-positives Bakterium erreicht. Auch wurde die artübergreifende Anwendung der hier konstruierten, für B. megaterium optimierten, Plasmide demonstriert.