Biochemische und funktionelle Charakterisierung der Subtilase SISBT3 aus Solanum Iycopersicum L (Tienda española)

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Subtilasen gehören zu der Familie der Subtilisin-ähnlichen Serinprotasen und sind sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Organismen weit verbreitet. Im Tierreich steuern Subtilasen als Proprotein-Konvertasen wichtige physiologische Prozesse wie z.B. die Reifung von Peptidhormonen, Wachstumsfaktoren und Rezeptorproteinen. Die Rolle der den Proprotein-Konvertasen ähnlichen Subtilasen in Pflanzen ist erst in wenigen Fällen für einzelne Enzyme aus Arabidopsis thaliana beschrieben. Ihre Funktion in Tomatenpflanzen ist noch völlig ungeklärt. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass Subtilasen in Tomatenpflanzen eine wesentliche Rolle bei der Regulation der Wundantwort und Pathogenabwehr spielen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die funktionelle Charakterisierung der Subtilase SlSBT3 aus Tomatenpflanzen mittels Aufreinigung und biochemischer Charakterisierung des rekombinanten Proteins, detaillierter Expressionsstudien in Tomatenpflanzen, sowie phänotypischer Analyse transgener Pflanzen mit veränderter Expression von SlSBT3 (SlSBT3-RNAi- und SlSBT3-Über¬expressionspflanzen).
Die Subtilase wurde mittels fraktionierter Ammoniumsulfat-Fällung, Kationen-Austausch¬chromatographie im Batch-Verfahren und Anionen-Austauschchromatographie aus einer SlSBT3-überexprimierenden Tomatenzellsuspensionskultur bis zur Homogenität gereinigt. Basierend auf der erfolgreichen Aufreinigung des Proteins aus einem homologen System konnte SlSBT3 am Chemical Genomics Centre (Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie, Dortmund) kristallisiert und strukturell analysiert werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte damit erstmalig die Kristallstruktur einer pflanzlichen Subtilase vorgelegt werden.
Die biochemischen Daten zeigten, dass SlSBT3 ungewöhnlich stabil und bei Temperaturen bis 60 °C vollständig aktiv ist. Bei pH 11 wies das Enzym immer noch über 60 % seiner proteolytischen Aktivität auf. Die aufgereinigte Subtilase war in der Lage in vitro das
Systemin-Peptid, ein wichtiges Signalmolekül der Wundantwort in Tomatenpflanzen, an einer einzigen Stelle, C-terminal der Aminosäure Gln16 zu spalten und dadurch zu inaktivieren. Detaillierte Untersuchungen zur Substratspezifität des Enzyms bestätigten die Präferenz der rekombinanten SlSBT3 für Glutamin in der P1-Position, sowie für basische Aminosäuren in den Positionen P2 und P1’ ihrer Substrate. Die eingeschränkte Substratspezifität von SlSBT3 legte nahe, dass dieses Enzym an selektiver Proteinprozessierung bzw. limitierter Proteolyse beteiligt ist und auf diese Weise spezifische Aufgaben in physiologischen Prozessen in der Pflanze erfüllt.
Die Expression von SlSBT3 konnte in allen untersuchten Organen vor allem im vaskulären Gewebe gezeigt werden. Detaillierte Analysen wiesen eine SlSBT3-Expression in Xylemparenchym- und Phloemzellen nach, wo auch das Vorläuferprotein von Systemin exprimiert wird. Die Expression von SlSBT3 wurde durch mechanische Verwundung sowie durch Fraß von Manduca sexta–Larven

induziert. Diese Befunde, nämlich die Induzierbarkeit der SlSBT3 Expression durch Verwundung, die Co-lokalisation von SlSBT3 und Prosystemin und die in vitro gezeigte Inaktivierung von Systemin durch SlSBT3, deuteten auf eine mögliche Beteiligung der Subtilase an der Regulation der Wundantwort in Tomatenpflanzen hin. Diese Annahme konnte jedoch durch einen Vergleich der Aktivität wundinduzierter Proteinaseinhibitoren als Markerproteine der Insektenabwehr in SlSBT3-RNAi-, SlSBT3-Überexpressions- und Wildtyp-Pflanzen nicht bestätigt werden.
Anhand der Entwicklung von Manduca sexta-Larven auf SlSBT3-RNAi-, SlSBT3-Überexpressions- und Wildtyp-Pflanzen wurde eine mögliche Beteiligung von SlSBT3 an Abwehrreaktionen von Tomatenpflanzen im Hinblick auf eine Veränderung in der Resistenz der Pflanzen untersucht. Die Überexpression von SlSBT3 reduzierte die Verweildauer von Manduca sexta–Larven auf den Futterpflanzen. Darüber hinaus konnte im hoch alkalischen Milieu des Darmes von Manduca sexta-Larven, welche auf SlSBT3-Überexpressionspflanzen gefressen hatten, intakte SlSBT3 nachgewiesen werden. Diese beiden Ergebnisse in Verbindung mit dem alkalischen pH-Optimum der Subtilase sind deutliche Hinweise darauf, dass SlSBT3 im Verdauungstrakt von Insekten wirksam ist und somit eine Rolle bei der pflanzlichen Abwehr gegenüber Herbivoren spielen könnte.
Die erzielten Ergebnisse bilden die Grundlage zur noch ausstehenden vollständigen Aufklärung der Funktion der Subtilase SlSBT3 bei der Abwehrreaktion von Tomatenpflanzen gegenüber Herbivoren. Die gewonnenen Erkenntnisse aus der Analyse der Kristallstruktur von SlSBT3 werden darüber hinaus auch für die Erforschung anderer pflanzlicher Subtilasen und ihrer physiologischen Rolle von entscheidender Bedeutung sein.