Konfokale Einzelpartikel-Detektion von fluoreszenz-kodierten Nanospheres. (Tienda española)

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Ziel dieser Arbeit war es, einzelne fluoreszenz-kodierte Nanopartikel von der
Größe 20-40 nm bei diffusiven Durchgängen durch ein konfokales Fokalvolumen
mit einem Radius von 200-300 nm identifizieren und charakterisieren zu können.
Hintergrund hierbei ist, dass durch die Kodierung eine große Anzahl
verschiedener Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen in kurzer Zeit in einem
einzelnen parallelen Reaktionsansatz untersucht werden kann, was
insbesondere bei Massendurchsatzverfahren, wie z.B. der DNA-Analyse oder
der Analyse von Glycokonjugaten, von Vorteil ist. Zunächst wurde hierzu eine
konfokale Mikroskopapparatur mit einer gepulsten Ti:Sa-Laserquelle zur
Zweiphotonen-Anregung aufgebaut und detektionsseitig die emittierte Fluoreszenz
in drei spektralen Regionen separat aufgezeichnet. Die aus den Messungen erhaltenen
Daten wurden dann mit einer selbst programmierten Software ausgewertet.
Für die parallelisierten Messungen
mussten effektive Identifikationsalgorithmen programmiert, evaluiert und getestet
werden. Hierzu war es erforderlich, zur Differenzierung geeignete Charakteristika
der auftretenden Photonenbursts zu finden und die zur Verfügung stehenden
Nanopartikel diesbezüglich zu analysieren. Aus den Absorptions- und Emissionsspektren
der Partikel zeigte sich bei den mehrfach gefärbten Typen, dass insbesondere bei der
Zweiphotonen-Anregung effektiv nur das am langwelligsten emittierende Fluorophor
Photonen abgibt. Es stellte sich heraus, dass hierfür effektive
Förster-Resonanz-Energietransfer-Prozesse (FRET) verantwortlich sind, die durch
große Spektralüberlappungen und kleinen Fluorophorabständen in den Partikeln
begünstigt werden. Dadurch, dass die Unterscheidung mehrfach angefärbter Partikeltypen
anhand ihrer Fluoreszenzemissionen durch FRET-Prozesse erschwert ist, wurde zunächst
die parallele Unterscheidung einfach angefärbter Typen untersucht. Für
diese Typen wurden dann über multiple Messungen typenreiner Proben
Filterverteilungen der Identifikationsparameter aufgenommen und abgeschätzt,
inwiefern die Identifikationsalgorithmen in der Lage sein sollten, sie zu
unterscheiden. Um Einflüsse von Burstüberlappungen und peripheren Passagen
zu quantifizieren, wurde eine Simulation programmiert und die verschiedenen
Algorithmen auf die resultierenden Zeitspuren angewendet.
Die Effizienz verschiedener Algorithmen die einzelnen Typen zu differenzieren,
wurde dann zunächst an fünf Einpartikelsystemen getestet wobei eine nahezu
hundertprozentige Identifikation erreicht wurde. Die Anwendung der Algorithmen
auf alle möglichen Permutationen an Mehrkomponentensystemen zeigte
teilweise geringfügig höhere Fehlerraten als bei den Einkomponentensystemen,
allerdings konnten einzelne Nanopartikel immer noch mit einer Sicherheit von
mehr als 95 % identifiziert werden. Bei der Analyse von einzelnen Fluoreszenzbursts
konnten weitere interessante Phänomene beobachtet werden. So zeigten Messungen der
Fluoreszenzlebensdauer an Ensembles einiger Partikel und bei der
Einzelburstfluoreszenzlebensdauer aller Partikel eine Abhängigkeit von der
Anregungsleistung. Die Begründung liegt hierbei in der Zunahme äußerst
effektiver zusätzlicher FRETWege angeregter Zustände. Darüber hinaus wurden
Effekte auf die
Fluoreszenzlebensdauer als Funktion der Partikelgröße beobachtet. Der
Vergleich von Partikeln verschiedener Größe zeigte eine Reduzierung der
Lebensdauer mit zunehmender Partikelgröße, was durch die Veränderung der
Populationsverhältnisse zugunsten der schneller relaxierenden Fluorophore im
Kugelkern bedingt ist. Weitere Effekte auf die Komponenten der
Fluoreszenzabklingdynamiken konnten durch veränderte Geometrie und
multiplen Homoenergietransfer erklärt werden. Bei der Autokorrelationsanalyse
zeigte sich eine stark typenspezifische Abhängigkeit des Fokalvolumens von der
Laserleistung, die proportional zur jeweiligen Anregbarkeit der Partikel war.
Zusammenfassend ist es gelungen, extrem effiziente Identifikationsalgorithmen
für diffusive Durchgänge einzelner Nanopartikel zu entwickeln.Zukünftige Arbeiten
werden sich mit der selektiven Bestückung der verschiedenen Partikel mit
unterschiedlichen Liganden und parallelisierten Messungen ihrer Interaktionen
mit Zielmolekülen, wie z.B. Lektinen, befassen. In einer in ChemBioChem ¹²
veröffentlichten Arbeit, konnte unsere Arbeitsgruppe bereits zeigen, dass die
Belegung von einfach gefärbten Nanopartikeln mit unterschiedlichen Oligosacchariden
die Messung von relativen Lektin- Bindungsaffinitäten erlaubt. Diese Messungen
lassen sich mit dem in dieser Arbeit entwickelten Verfahren nun auf die simultane
Messung von Affinitäten und Kreuzaffinitäten ganzer Oligosaccharid-Bibliotheken erweitern.
Die durch FRETProzesse verursachte Differenzierungsproblematik bei mehrfach angefärbten
Nanopartikeln wird sich in zukünftigen Entwicklungen durch selektive Anregung
der unterschiedlichen Absorptionsbanden, die auch als Kodierungsmerkmal
verwendet werden können, umgehen lassen.