Autodisplay von Nitrilasen zur Umsetzung von Nitrilen zu Carbonsäuren (Tienda española)

Previo

Indice, Datei (69 KB)
Lectura de prueba, Datei (170 KB)

Descripcion

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die putative Nitrilase aus Saccharomyces cerevisiae (NitSc), die Nitrilase aus Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae (NitKp) und die Nitrilase aus Alcaligenes faecalis subsp. faecalis (NitAf) als Autodisplay-Passagiere auf der Zelloberfläche von Escherichia coli präsentiert. Die Oberflächenständigkeit der Passagierdomäne der erzeugten Autodisplay-Fusionsproteine NitSc-AT, NitKp-AT und NitAf-AT konnte mittels Proteasezugänglichkeitstest nachgewiesen werden. Für das lediglich aufgrund von Sequenzhomologien zur Enzymklasse der Nitrilasen zählende Enzym NitSc ist bisher noch kein Substrat bekannt. Zum Nachweis einer Nitrilaseaktivität wurde deshalb eine repräsentative Auswahl an aliphatischen, aromatischen und arylaliphatischen Verbindungen als Substrat getestet. Mit der getroffenen Auswahl war es für NitSc-AT tragende E. coli BL21 Zellen nicht möglich eine Nitrilaseaktivität nachzuweisen. Demgegenüber konnte für NitKp-AT tragende E. coli BL21 Zellen eine Nitrilaseaktivität nachgewiesen werden. Dabei akzeptierte NitKp-AT, wie das freie Enzym NitKp, Bromoxynil, Chloroxynil und Ioxynil als Substrat. Desweiteren konnte für NitKp-AT das Substratspektrum mit 3-Fluor-4-hydroxybenzonitril und 3,5-Dimethyl-4-hydroxybenzonitril auch auf fluorierte und nichthalogenierte Verbindungen ausgeweitet werden, die bisher noch nicht als Substrate für das freie Enzym NitKp beschrieben wurden. Durch die Expression des Autotransporter Fusionsproteins NitAf-AT in E. coli BL21 konnte zum ersten Mal das Autodisplay eines multihomomeren Enzyms gezeigt werden, das aus bis zu 14 identischen Untereinheiten bestehen kann. Der erzeugte Ganzzell-Biokatalysator akzeptierte Phenylacetonitril und Mandelsäurenitril als Substrat, wobei Phenylacetonitril fünf Mal schneller umgesetzt wurde als Mandelsäurenitril. Die bei 37 °C erzeugte Mandelsäure wies einen Enantiomeren¬überschuss von 99,2 % für das R-Enantiomer auf. Nach fünf zyklisch wiederholten 24-stündigen Umsetzungen in Tris-HCl pH 7 bei 30 °C konnte eine Restaktivität von 58 %, bezogen auf die Mandelsäureproduktion im ersten Reaktionszyklus, nachgewiesen werden. Der mit Mandelsäurenitril als Substrat für NitAf-AT ermittelte Km-Wert lag in der gleichen Größenordnung wie der aus der Literatur bekannte Km-Wert für das freie Enzym NitAf. Bei der Kultivierung von NitAf-AT tragenden Zellen im Fermenter konnte eine maximale Trockenzellmasse von 6,8 g L-1 erzielt werden. Die nachfolgende Umsetzung von Mandelsäurenitril zu R-Mandelsäure im Fermenter führte zu einer durchschnittlichen Raum-Zeit-Ausbeute von 0,31 g L-1 d-1 Mandelsäure. Im Vergleich zur Umsetzung mit Schüttelkolbenkulturen bedeutete dies eine Verdopplung der Mandelsäureproduktion. Der Enantiomerenüberschuss für die im Fermenter bei 45 °C erzeugte R-Mandelsäure lag bei 95,8 %. Somit konnte zum ersten Mal die generelle Eignung eines Autodisplay-Ganzzell-Biokatalysators zur Kultivierung im Fermenter sowie der anschließenden Umsetzung von Mandelsäurenitril im 2 L-Maßstab belegt werden.