Untersuchung von putativen Diaminoxidasen für die Pyrrolizidin-Alkaloid-Biosynthese (Tienda española)

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Aus der Pyrrolizidin-Alkaloid (PA)-haltigen Pflanze Senecio vernalis wurden drei Diaminoxidasen (SVAO1, SVAO2 und SVAO3) identifiziert (Denker, 2008). Um diese auf eine mögliche Beteiligung an der PA-Biosynthese zu untersuchen, wurden SVAO1 und SVAO2 bereits in der Vergangenheit heterolog exprimiert (Denker, 2008). Im Rahmen dieser Arbeit wurde SVAO3 in E. coli heterolog exprimiert, was zu Inclusion bodies-Bildung führte. Auch eine Coexpression mit Chaperonen führte nicht zur Expression löslichen Proteins. Die bisherige Vermutung, dass es sich bei SVAO3 um eine kleine Gen-Familie handeln könnte, wurde bestätigt, da zwei weitere Vertreter dieser Familie im Rahmen dieser Arbeit identifiziert werden konnten.
Um über den Expressionsort der drei SVAOs auf deren Funktion schließen zu können, wurden gewebespezifische RT-PCRs in S. vernalis durchgeführt. Dabei wurden Transkripte des svao3-Gens in allen Pflanzenorganen von S. vernalis, solche des svao2-Gens in Blatt und Spross und Transkripte des svao1-Gens nur in der Wurzel lokalisiert. Da sich die gesamte PA-Biosynthese in S. vernalis in der Wurzel befindet, wurde SVAO1 zum „hoffnungsvollsten Kandidaten“ der drei SVAOs für eine mögliche Beteiligung an der PA-Biosynthese. Ebenfalls zur Lokalisierung der mRNA der drei SVAOs wurden in situ-Hybridisierungen in der Wurzel von S. vernalis durchgeführt. Mit einer Kombination von Sonden gegen mRNA des svao1- und svao3–Gens wurde ein Signal nahe dem Expressionsort der Homospermidin-Synthase, dem Eingangsenzym der PA-Biosynthese, detektiert. Daraus entstand die Vermutung, dass die gesuchte Diaminoxidase Strukturmerkmale von SVAO1 und SVAO3 besitzen könnte.
Um die Funktionen der drei SVAOs in planta zu untersuchen, wurden S. vernalis und Nicotiana tabacum mit Konstrukten zur Überexpression und Herunterregulation der Expression der drei SVAOs mittels Agrobacterium rhizogenes transformiert. Sowohl GUS-Tests, als auch PCRs mit der genomischen DNA der Hairy Root (HR)-Klone bestätigten die erfolgreiche Transformation beider Versuchspflanzen. Damit wurde S. vernalis erstmalig mit A. rhizogenes transformiert. PA-Analysen der Senecio-HRs zeigten jedoch nur in der SVAO3-Überexpressions-Kultur eine Tendenz der Herabregulation der Gesamt-PAs, die möglicherweise durch die Cosuppression einer an der PA-Biosynthese beteiligten DAO verursacht wurde. Auch eine Analyse der Transkriptmengen der Fremd-DNA durch semiquantitative RT-PCR konnte die Expression der integrierten SVAO-Konstrukte nicht bestätigen. Hingegen wurden Transkripte des in die Klonierungskassette integrierten enhanced green fluorescent protein (egfp)-Gens bei einigen RNAi-Klonen nachgewiesen. In den Überexpressions-HR-Kulturen wurden keine Transkripte des egfp-Gens nachgewiesen. Möglicherweise ist das auf den eingesetzten rolD-Promotor in den Überexpressions-Konstrukten zurückzuführen.
In Tabak führte die Überexpression von SVAO1 und SVAO3 zu keiner Veränderung des Alkaloid-Spektrums, die durch 1H-NMR hätte nachgewiesen werden können. RT-PCRs von einigen ausgewählten Proben zeigten jedoch, dass SVAO1 zum Teil exprimiert wurde.