Molecular genetics analysis of in vitro produced preimplantation stage_Bovine embryos for developmental competence

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Beschreibung

Die Hauptziele dieser Studie waren die Identifikation von Kandidatengenen für die Embryoentwicklungskompetenz sowie die Kartierung von Genen auf den bovinen Chromosomen. Darüber hinaus wurden Transkripte des Retinoid X Rezeptors quantifiziert, um sie mit Qualitätsparametern für Embryonen zu vergleichen. Dazu wurden verschiedene Pools an Embryonen mit unterschiedlichen Entwicklungsstadien und Qualitäten hergestellt. Hieraus wurde mRNA für die cDNA-Synthese isoliert. Zudem wurden cDNA Mikroarrays aus selbst identifizierten spezifischen Genen für das Präimplantationsstadium erzeugt. Ein RNA Amplifikationsverfahren wurde etabliert und mit cDNA-Mikroarray und der Realtime-PCR geprüft. Beide Resultate bestätigen, dass mit einer kleineren Zahl von Amplifikationszyklen eine ausreichende RNA Menge mit der besten Transkript- Repräsentanz erzielt werden kann. Mit diesen etablierten Verfahren wurden Proben aus maturierten Oozyten und Embryonen im Blastozystenstadium vorbereitet und auf dem Mikroarray hybridisiert. Die Analyse der Hybridisationen ergab 35 unterschiedlich exprimierte Gene und ESTs (p ≤ 0.05). Um die Resultate des Mikroarrays zu überprüfen, wurden 24 Gene mit einer Realtime-PCR validiert. Bei 22 Genen wurden die Resultate bestätigt. Nachfolgend wurden die Transkripte des Retinoid X Rezeptors, denen eine signifikante Aufgabe bei der Embryoentwicklung zukommt, mit der Realtime PCR Technik quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Expressionsniveaus von Retinoid X Rezeptor Alpha (RXRA) und Beta (RXRB) bei Embryonen guter Qualität höher sind als bei Embryonen schlechter Qualität. Im Vergleich zu der von Embryonen regulierten Phase zeigen beide Transkripte ein höheres Transkriptionsniveau während der maternalen Entwicklungsphase. Rezeptor Gamma (RXRG) wurde jedoch nur in ungefähr einem Drittel der Proben identifiziert. Schließlich wurden 16 Gene auf verschiedenen bovinen Chromosomen mit Hilfe eines 5000rad bovinen Radiation-Hybrid Kartierungs-Panels kartiert.