Charakterisierung eines safenerinduzierbaren Promotors und Analyse der safenerabhängigen Genexpression in Arabidopsis thaliana

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Safener werden vielen modernen nichtselektiven Herbiziden beigemischt. Dies führt zur selektiven Aktivierung metabolischer Vorgänge in Kulturpflanzen, die zu einem schnelleren Abbau des Herbizides führen. Eine solche Wirkung kann in den Zielunkräutern jedoch nicht beobachtet werden. Durch Safener wird die Toleranz der Kulturpflanze gegenüber dem nichtselektiven Herbizid erhöht. Diese Wirkung konnte bislang nur in monokotylen Kulturpflanzen nachgewiesen werden. Ein besseres Verständnis der Regulationsmechanismen, die zu einer erhöhten Herbizidmetabolisierung in Kulturpflanzen führt, ist ein wichtiger Aspekt der Safenerforschung. Ziele dieser Arbeit waren die Charakterisierung von Elementen des Safenersignalsweges, sowie eine Analyse der safenerinduzierten Genexpression in der dikotylen Modellpflanze Arabidopsis thaliana.

Charakterisierung der Safener Signaltransduktion in A. thaliana
Zu diesen safenerinduzierbaren Enzymen des pflanzlichen Detoxifizierungssystem gehören unter anderem Glutathion-S-Transferasen (GSTs). Um cis-regulatorische Elemente des Safenersignalweges zu charakterisieren, wurde der Promotor des Mais In2.1 Gens verwendet. Dieses Gen kodiert für eine GST der hoch safenerinduzierbaren lambda Klasse (GSTLs) der GST-Superfamilie. Aufgrund der zuerst in Mais beschriebenen massiven Induktion von GSTLs durch Benzensulfonamid-Safener werden diese GSTs auch als „In2.1-Proteine“ bezeichnet. Der Promotor des In2.1-Gens wurde mit dem -Glucuronidase (GUS) Reportergen fusioniert und in das Arabidopsis thaliana Genom integriert.
Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass für die Safenerinduzierbarkeit des In2.1-Promotors durch Mefenpyr und Isoxadifen ein 100 bp langer Sequenzabschnitt relevant ist. Auf dieser Sequenz konnten zwei as-1- bzw. ocs-Elemente identifiziert werden. Die Deletion eines dieser Motive führte zu einer verringerten Safenerinduzierbarkeit des Promotors.
Die Bindung von zwei TGA-Transkriptionsfaktoren (TGA2/5) an eines dieser as-1-Elemente in vivo wurde in einem Chromatin Immunopräzipitationsexperiment nachgewiesen. Die Relevanz dieser Faktoren für die Induzierbarkeit des In2.1-Promotors, wurde durch eine Transformation des PIn2.1:GUS Konstruktes in eine TGA-Transkriptionsfaktor knockout Mutante (tga2/3/5/6) bestätigt.
TGA-Faktoren benötigen für die Induktion der Transkription einen Kofaktor. Ein solcher Interaktionspartner ist NPR1 (non expressor of PR genes). Zusammen mit TGA Faktoren führt er zur Expression von PR1 (pathogenesis-related protein 1), einem Markergen der systemisch erworbenen Resistenz. Die Beteiligung dieses Kofaktors am Safenersignalweg wurde über die Transformation des PIn2.1:GUS-Konstruktes in eine entsprechende Mutante überprüft (sai1-1; salicylic insensitive 1). Der Safenersignalweg konnte hierbei als NPR1-unabhängig bewertet werden.
TGA-Transkriptionsfaktoren, as-1-Elemente, als auch die Akkumulation von Salizylsäure nach Pathogenbefall spielen eine wichtige Rolle für den Salizylsäuresignalweg, der zur Etablierung der systemisch erworbenen Resistenz führt. Da der In2.1-Promotor ebenfalls stark salizylsäureinduzierbar ist, wurde der Einfluss des internen Salizylsäuregehaltes auf die Induzierbarkeit des Promotors durch Mefenpyr und Isoxadifen überprüft. Eine niedrige endogene Salizylsäurekonzentration führte zu einem Verlust der Safenerinduzierbarkeit des Mais-Promotors in transgenen Salizylsäurebiosynthese-Mutanten (NahG, sid2-2). Der Einfluss der Applikation von Mefenpyr und Isoxadifen auf die Salizylsäurebiosynthese in Wildtyp (WT), sid2-2- und NahG-Pflanzen, wurde 2-6 h nach Safenerapplikation untersucht. Weder im WT noch in den Salizylsäurebiosynthesemutanten konnte eine durch Mefenpyr und Isoxadifen induzierte SA-Biosynthese nachgewiesen werden.
Um weitere noch unbekannte Elemente des Safenersignalweges zu identifizieren bietet sich ein Mutantenscreen an. Um hierfür die Voraussetzungen zu schaffen, wurden im Rahmen dieser Arbeit homozygote Arabidopsis Pflanzen mit dem Luciferase-Reportergen unter Kontrolle des In2.1-Promotors generiert. Nach Mutagenese der Samen dieser Reporterlinie werden sich sowohl „loss-of-function“ (keine Reportergenexpression nach Safenerbehandlung) als auch „gain-of-function“ Mutationen (konstitutive Reportergenexpression ohne Safenerbehandlung) identifizieren lassen.

Die Genexpression in mit Mefenypr und Isoxadifen behandelten A. thaliana
Die Wirkung von Mefenpyr und Isoxadifen auf die Genexpression von diktoylen Pflanzen, wurde durch ein Micro-Array-Experiment (ATH1 Gene Chip, Affymetrix) untersucht. Verwendung fanden hierbei die bereits für die Charakterisierung des In2.1-Promotors eingesetzten Wildtyp- und Mutantenpflanzen (tga2/3/5/6, sid2-2, NahG).
In Wildtyppflanzen konnte die Induktion von Genen verschiedener Phasen des pflanzlichen Detoxifizierungssystems (P450s, GSTs, GTs, Transporter) als auch eines endogenen In2.1-Gens nachgewiesen werden. Die induzierten GSTs gehören hauptsächlich zur tau Klasse (GSTUs) der GST-Superfamilie. Die Induktion von GSTs in A. thaliana kann, wie auch in Monokotylen, als statistisch signifikant für die Safenerantwort bewertet werden. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von früheren Untersuchungen der safenerinduzierten GST-Expression in Arabidopsis in denen nach Behandlung mit dem Safener Benoxacor hauptsächlich die Induktion von phi Klasse GSTs (GSTFs) nachgewiesen wurde. Offensichtlich wirken verschiedene Safener selektiv auf die Genexpression von phi und tau-Klasse GSTs in A. thaliana was zuvor auch in Monokotylen beobachtet wurde.
Der Einfluss der TGA-Transkriptionsfaktoren auf den Safenersignalweg konnte durch das Genexpressionsexperiment mit der TGA-knockout Mutante bestätigt werden. Etwa die Hälfte der im Wildtyp safenerregulierten Gene sind durch diese Mutation betroffen. Unter den safenerregulierten Genen in Wildtyppflanzen wurde eine statistisch signifikante Induktion von WRKY-Transkriptionsfaktoren und eine Überrepräsentation von WRKY-Transkriptionsfaktor Bindungsstellen in den Promotorsequenzen nachgewiesen. Eine Beteiligung von WRKY-Transkriptionsfaktoren im Safenersignalweg ist aufgrund dieser Ergebnisse sehr wahrscheinlich.
Die Ergebnisse wurden in einem Modell des Safenersignalweges zusammengefasst. Dieses Modell stellt eine gute Basis für weiterführende Versuche zur Charakterisierung der Safener gesteuerten Signalkaskade dar. Aufgrund der vielen Parallelen hinsichtlich der Safenerantwort in mono- und dikotylen Pflanzen scheint es wahrscheinlich, dass künftig doch noch Safener für dikotyle Kulturpflanzen zu finden sein werden.