Application of disaccharides pre-treatment in improving tolerances of Lactobacillus rhamnosus strains to environmental stresses or during vacuum- and spray drying processes

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Probiotische Mikroorganismen sind während Fermentation, Einsatz im Produkt und Verzehr
schwankenden Umweltbedingungen ausgesetzt, die sich durch die Entwicklung von Stress-
erkennungs und –anpassungsmechanismen teilweise ausgleichen können. Da der gesund-
heitsfördernde Effekt von Probiotika durch den Konsum einer täglichen Dosis von mindes-
tens 108 lebenden Zellen erreicht werden kann, sollten diese umweltbedingten Stressfakto-
ren genutzt werden, um das Überleben der Mikroorganismen sowohl während der
Prozessierung als auch im Lebensmittel bis zum Ende der Mindesthaltbarkeit zu garantieren.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Anwendung von Trehalose und Sucrose zur Induktion
von osmotischem Stress bei Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) und Lactobacillus
rhamnosus E-97800 (E800) und die Eignung dieser Substanzen als Trägermedium bei der
nachfolgenden Sprüh- und Vakuumtrocknung.
Durchflusszytometrie, Keimzahlbestimmung und die Anwendung der Rasterelektronenmikro-
skopie wurden als wesentliche analytische Methoden zur Charakterisierung von Lb.
rhamnosus eingesetzt. Ein Verlust der Membranintegrität wurde bei LGG nur nach Behand-
lung in einer 1.5 M Sucrose Lösung festgestellt. Permeabilisierung der Zellmembranen war
verstärkt, wenn E800 in Trehalose-Medium behandelt wurde. Es wurde eine Reparatur von
Membranschäden nach Re-kultivierung in Wachstumsmedium beobachtet. Trehalose war im
Vergleich zu Sucrose besser in der Lage, die Ausschleusungsfähigkeit der Zellen zu verbes-
sern, die als ein Schutzmechanismus gegen toxische Metaboliten verstanden werden kann.
E800 war dabei hinsichtlich der Dauer des Ausschleusungsvorganges weniger aktiv als
LGG. Morphologische Veränderungen in Richtung kapselähnlicher Formen wurden bei LGG
beobachtet. Die Reaktion auf osmotischen Stress war stammspezifisch.
Eine osmotische Vorbehandlung im sub-lethalen Bereich wurde eingesetzt um den Einfluss
auf die Zellstabilität unter anderem Stressbedingungen wie lethale Salzkonzentrationen, Hit-
ze oder lethaler osmotischer Stress, die während der Verarbeitung bzw. im Intestinaltrakt
auftreten können, zu untersuchen. Trehalose verbesserte die Salztoleranz von LGG während
es die Hitzetoleranz von E800 drastisch reduzierte.
Die Überlebensrate der Lb. rhamnosus Stämme in ausgewählten Disacchariden nach Vaku-
umtrocknung bei 25°C und anschließender Lagerung wurde untersucht.
Durchflusszytometrische Analysen und die Bewertung der Toleranz der Mikroorganismen
gegenüber Selektivmedien dienten der Charakterisierung der Zellschädigung während des
Trocknungsprozesses. Trehalose verbesserte dabei die Erholung lebender Zellen nach der
Trocknung und während der Lagerung bei 4°C und 25°C. Membranschäden und eine Verrin-
gerung der Koloniegrößen wurden als Resultate der Schädigung während der Trocknung
beobachtet. Der Vergleich konventioneller Kultivierungstechniken mit den Ergebnissen der
Durchflusszytometrie zeigte eine bestimmte Zellfraktion, die durch Stressung die Fähigkeit
zur Vermehrung auf dem Nährmedium verloren hatte.
Die Verwendung von Trehalose und der Einfluss von enthaltenem Mononatriumglutamat auf
die Überlebensrate wurde während der Sprühtrocknung und der Lagerung untersucht. Mittels
Durchflusszytometrie und der Bewertung der Toleranz der Bakterien gegenüber Selektivme-
dien erfolgte die Charakterisierung und Lokalisierung auftretender Zellschäden während der
Sprühtrocknung. Sprühgetrockneter LGG wurde in Lebensmittel eingebracht und die Lager-
stabilität des Keims untersucht. Während der Sprühtrocknung wurde eine Luftaustrittstempe-
ratur von 65-70°C als optimale Prozesstemperatur ermittelt und die resultierenden Wasser-
gehalte des Pulvers aus Trehalose und E800 bzw. LGG betrugen 4.1% (w/w) bzw. 3.79 %
(w/w) mit Lebendzellzahlen von 3.65 × 108 KBE/ml bzw. 1.8 × 109 KBE/ml im resuspendierten
Produkt. Dabei wurden Zellmembranschäden und Schäden an der Zellwand festgestellt. Die
aus der Gefriertrocknung bekannten stabilisierenden Eingenschaften der Trehalose ließen
sich auf die Sprühtrocknung übertragen, aber nicht auf die Lagerung. Jedoch das Hinzuge-
ben von Mononatriumglutamat verbesserte den Schützenden Effeckt von Trehalose. Schutz
vor oxidativem Stress durch Mononatriumglutamat konnte bei der Lagerung festgestellt wer-
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den und eine Überlebensrate von mindestens 108 KBE/ml wurde nach 6 Wochen bei einer
Lagertemperatur von 25°C erreicht.
Die Nicht-Sichtbarkeit der getrockneten Bakterien in Trehalose pulver deutet deren Verkap-
selung an. Aber die verbesserten Überlebensraten bei Mononatriumglutamat waren Anzei-
chen von Schutz vor oxidativem Stress neben anderen Mechanismen, deren Aufklärung wei-
terer wissenschaftlicher Arbeit bedarf.
Die Keimzahl von LGG nach Einbringen in Apfelsaft und einer Lagerung von 12 Tagen bei
4°C betrug 105 KBE/ml, in Instant-Kakao-Mischgetränk wurde nach 10 Wochen Lagerung bei
25°C eine Keimzahl von 107 KBE/g detektiert, wobei in beiden Fällen eine Ausgangskeim-
zahl von 109 KBE/ml bzw. g eingestellt wurde.
Die Überlebensrate und Stabilität der Lb rhamnosus Stämme während der Verarbeitung und
Lagerung wurden durch die Anwendung osmotischer Stressbedingungen verbessert.