Das Basalapparat-Subproteom von Chlamydomonas reinhardtii (English shop)

Preview

Table of Contents, Datei (49 KB)
Extract, Datei (69 KB)

Description

Der Basalapparat der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii besteht aus den beiden geißeltragenden Basalkörpern sowie aus zwei Probasalkörpern und assoziierten Fibrillen und Mikrotubuli. Der ultrastrukturelle Aufbau der Basalkörper stimmt weitgehend mit dem der Centriolen tierischer Centrosomen überein: Neun ringförmig angeordnete Mikrotubulitripletts bilden einen Zylinder von ca. 400 nm Länge. In Querschnitten lassen sich verschiedene Strukturen wie das „cartwheel” im proximalen Bereich der Basalkörper oder die Sternstruktur in der Übergangsregion zur Geißel unterscheiden. Die beiden Basalkörper sind miteinander über Verbindungsfibrillen verbunden und durch die „transitional fibers” an der Plasmamembran angeheftet. Ausgehend von den Basalkörpern verlaufen die sogenannten Geißelwurzeln ins Zellinnere. Sie verbinden den Basalapparat mit verschiedenen Zellorganellen und sind somit an der inneren Organisation der gesamten Zelle beteiligt. Da über die Proteinzusammensetzung der Basalapparate bisher wenig bekannt war, sollte in dieser Arbeit das Proteom der Basalapparate von C. reinhardtii näher charakterisiert werden.
Zur Identifikation der Proteine wurde zunächst eine Reinigungsmethode für Basalapparate von C. reinhardtii entwickelt. Die gereinigten Basalapparate wurden anschließend elektrophoretisch in einem 1D-SDS-PAGE aufgetrennt, das komplette Gel in 51 Banden zerschnitten und die Banden massenspektrometrisch analysiert. Dieser erste Ansatz lieferte insgesamt 1123 unterschiedliche Peptide. Die Peptide konnten 124 Genmodellen, aber auch EST-Einträgen sowie genomischen Positionen, an denen sich bisher keine Genmodelle befanden, zugeordnet werden. In einem 2. Ansatz wurde ein Basalapparat-Pellet nach dem MudPIT-Verfahren („multidimensional protein identification technology”) direkt – ohne vorherige elektrophoretische Auftrennung – untersucht. In diesem Ansatz wurden 450 Peptide in 295 Genmodellen identifiziert. Darüber hinaus wurden Basalapparate reproduzierbar mittels 2D-PAGE in ca. 60-75 Spots aufgetrennt.
Da zu diesem Zeitpunkt bereits eine Veröffentlichung des Proteoms der Basalkörper von C. reinhardtii vorlag (ebenfalls durch MudPIT ermittelt), war ein direkter Vergleich der jeweils identifizierten Genmodelle möglich. Der Vergleich der 295 mit dem MudPIT-Verfahren identifizierten Genmodelle mit dieser Veröffentlichung lieferte eine Liste von 35 z.T. bekannten (wie z.B. α- und β-Tubulin, Centrin) und neuen, potentiellen Basalapparatproteinen.
Im Folgenden wurden fünf dieser neuen, potentiellen Basalapparatproteine, die bei den unterschiedlichen Ansätzen (1D-Gel-Ansatz und MudPIT-Verfahren) mit mehreren Peptiden identifiziert worden waren, näher charakterisiert. Einer dieser Kandidaten ist fälschlicherweise als mitochondrialer Translationsfaktor annotiert; hier wurden vermutlich zwei unterschiedliche Gene zu einem Modell zusammengefaßt. Für diesen Kandidaten wurde eine genomische Sequenzlücke geschlossen. Für die vier anderen Kandidaten wurden partielle cDNAs kloniert und zunächst sequenziert. Der Vergleich dieser Sequenzen mit den Genmodellen führte bei Kandidat 90 zur Entdeckung von zwei neuen Exons. Bei Kandidat 27 stellte sich heraus, dass Exon 6 um 42 bp länger ist als im Genmodell angegeben. Die cDNAs wurden in E. coli überexprimiert und die rekombinanten Proteine zur Erzeugung von polyklonalen Antikörpern in Kaninchen verwendet. In Western-Blots reagierten die Antikörper sowohl mit dem rekombinanten Protein der Bakterien als auch mit entsprechenden Proteinen in isolierten Basalapparaten. Drei der Proteine konnten mit Hilfe der Antikörper in der Immunfluoreszenzmikroskopie im Bereich des Basalapparates lokalisiert werden.